1. Produção e Aplicação de Biosurfactantes

Denise Freire (IQ - UFRJ), Rui de Paula (IQ - UFRJ) e Vanessa Rocha (IQ - UFRJ)

Os biossurfactantes são compostos de origem microbiana produzidos, principalmente, sob crescimento aeróbio e em meio aquoso, onde são excretados. Esses bioprodutos encontram aplicação em diversos setores da industria do petróleo, como, por exemplo, remediação de solos impactados com petróleo, recuperação melhorada de petróleo, solubilização de borras em tanques de armazenamento, prevenção ou remoção de depósitos parafínicos em colunas de produção de poços de petróleo e remoção de metais pesados.

Existem produtos microbianos comerciais disponíveis no mercado internacional com custo elevado e que já foram testados em regiões produtoras de petróleo. Os testes realizados com alguns desses produtos com petróleo brasileiro não demonstraram boa eficiência. Por outro lado, o biossurfactante obtido por meio da cooperação entre o Cenpes e a UFRJ demonstrou excelente eficiência na biorremediação de solos em testes realizados pelo próprio Cenpes.

Objetivos

• Estudar a produção de biossurfactantes por uma cepa pré-selecionada de Pseudomonas aeruginosa (CENPES / PETROBRAS) para degradar o petróleo em solos contaminados por derivados de petróleo;
• A aplicação do biossurfactante produzido em diferentes áreas impactadas em petróleo, Meor e outras aplicações ambientais.

Patentes

1. TITULO: CEPA DE Burkholderia Kururiensis Geneticamente Modificada e Método de Construção da referida Cepa, Método para Produção de Biossurfactantes do Tipo Ramnolipídeos e Usos.

   LIMA, P. F. ; TAVARES, LUIZ FERNANDO ; NEVES, B. C. ; FREIRE, DENISE M. G.

   Descrição: Este pedido de patente foi depositada pela UFRJ e trata da obtenção por meio de técnicas de biologia molecular de uma cepa de Burkholderia Kururiensis geneticamente modificada. Na patente são descritos o Método de Construção da referida Cepa, o método para produção de biossurfactantes do tipo ramnolipídeos e os usos deste bioproduto.

2. Biossurfactante e uso do mesmo em remediação de solo impactado por óleo. 2004. Patent INPI number PI 0405952-2.

   SANTAANNA, L.M.M.; FREIRE, D.M.G.; BORGES, C.P.; KRONENBERGER, F.A.; PEREIRA JR, N.

   Descrição: Este pedido de patente foi depositado pelo Cenpes e pela UFRJ e trata da produção e utilização de um biosurfactante do tipo raminolipideo obtido pro uma cepa de Pseudomonas aeruginosa PA1 isolada de poços de petróleo. Na patente estão descritos o modo de obtençãoo deste bioproduto e sua aplicaçãoo para remediaçãoo de ambientes contaminados com derramamento de petróleo e seus derivados.

3. TÍTULO: BIORREATOR INTEGRADO COM PROCESSOS COM MEMBRANAS PARA A PRODUÇÃO E RECUPERAÇÃO DE BIOPRODUTOS.

   Descrição: A presente invenção trata do projeto, construção e operação de um biorreator para a obtenção sob condições controladas de espuma e recuperação integrada de produtos biotecnológicos utilizando processos com membranas. Dentre os produtos biotecnológicos que podem ser obtidos, pode-se citar biossurfactantes e enzimas para a produção de biocombustíveis.

2. Produção, Purificação e Imobilização de Lipases

Denise Freire (IQ - UFRJ) Elisa Cavalcanti (IQ - UFRJ) e Erika Aguieiras (IQ-UFRJ)

Atualmente, as lipases respondem por cerca de 5% do mercado mundial de enzimas; entretanto, existe uma forte tendência de crescimento por conta do seu vasto campo de aplicação. Estas enzimas apresentam uma grande versatilidade de propriedades, tais como termoestabilidade, resistência a solventes orgânicos, especificidade, regioseletividade e estereoseletividade, razão pela qual sua participação no mercado mundial de enzimas industriais vem crescendo significativamente. A função biológica destas enzimas é primordialmente a de catalisar reações de hidrólise para liberar ácidos graxos e glicerol. Entretanto, em condições em que a água é restrita no meio, a maioria das lipases é capaz de exercer sua atividade catalítica em reações de alcoólise e transesterificação, de grande interesse para a indústria do petróleo.

O maior desafio encontrado na substituição dos catalisadores químicos pelas lipases na indústria do petróleo reside no elevado custo de produção, imobilização e da baixa estabilidade das mesmas. Além disso, as lipases comerciais disponíveis no mercado são importadas e de elevado custo, o que, na maioria das vezes, inviabiliza sua utilização em maiores escalas ou para produção de comodities de menor valor agregado. Desta forma, o presente projeto pretende contornar estes problemas investigando três principais pontos para redução do custo destas enzimas:

• Redução do custo de meios de cultivo;
• Aumento substancial da concentração da enzima no meio fermentado;
• Redução de etapas de concentração/purificação;
• Obtenção de biocatalisadores mais estáveis.

Objetivo Principal

O presente trabalho propõe a produção e imobilização de lipases, utilizando tecnologia nacional, visando a obtenção de biocatalisadores apropriados para a produção de bioprodutos de interesse da indústria do petróleo.

Objetivos

1. Estudar a produção de lipases e outras hidrolases fúngicas com o objetivo de compreender a fisiologia microbiana e, conseqüentemente, otimizar o processo de produção por cultura submersa (frascos agitados e fermentadores de bancada escala) e por fermentação em estado sólido utilizando resíduos agroindustriais;

2. Estudar a redução da alergenicidade e da toxicidade após o processo fermentativo de alguns dos rejeitos empregados;

3. Formular de modelos matemáticos para entendimento da relação entre a produção de hidrolases e o crescimento cellular de modo a otimizar os processos de produção destas enzimas;

4. Purificar e caracterizar as enzimas, especialmente a lipase, a fim de determinar a sua subsequente utilização em processos biotecnológicos;

5. Estudar a eliminação da etapa de purificação através da utilização de técnicas modernas de engenharia de suportes e produção dos mesmos com diferentes graus de hidrofobicidade utilizando tecnologia própria do Laboratório de Modelagem Simulação e Controle de Processos (COPPE -UFRJ);

6. Produzir lipases mais robustas e eficientes , através de técnicas de biologia molecular, amplamente dominadas pelos Laboratórios de Biologia Molecular da UNB (ICB) e da UFRJ (Instituto de Bioquímica Médica - CCS).

Patentes

1. CASTRO, A. M. ; FREIRE, Denise Maria Guimarães ; GODOY, Mateus Gomes de ; TAVARES, Olga Lima Machado ; GUTARRA, Melissa Limoeiro Estrada ; BEVILAQUA, Juliana Vaz ; SANTAANNA, Lidia Maria de Melo . Processo de produção de lipases e valoração de resíduo agroindustrial. 2009. Patent deposit.

   Descrição: Este pedido de patente foi depositado pelo Cenpes e pela UFRJ e trata de um processo de produção de lipases em resíduos agroindustriais oriundos da cadeia do biodiesel. O processo descreve o processo no qual os microrganismos destoxificam e enriquecem proteicamente diversos resíduos sólidos.

2. BEVILAQUA, J.V.; FREIRE, D.M.G.; SANTAANNA, L.M.M.; CASTILHO, L.R.; RIBEIRO, M.C.M.; GUTARRA, M.L.E.; GODOY, M.G. Método de tratamento de rejeito agroindustrial para destoxificação e redução da alergenicidade, com produção de lipases.. 2007. Patent INPI number PI 0703290-0.

   Descrição: Este pedido de patente foi depositado pelo Cenpes e pela UFRJ e trata de um processo destoxificação e redução da alergenicidadedo de um rejeito agroindustrial sólido obtido pela Petrobras a base de mamona . O pedido descreve também a obtenção de biocatalisador de baixo custo.

3. SANTANNA, L.M.M.; KHALIL, C.N.; PEREIRA JR, N.; MADEIRA, L.S.; FREIRE, D.M.G.; BEVILAQUA, J.V.; GOMES, A.C.; MENEZES, E.P. Processo para a Redução da toxicidade da Torta de Mamona. 2006. Patent INPI number PI0503543-0.

   Descrição: Este pedido de patente foi depositado pelo Cenpes e pela UFRJ e trata de um processo de produção de etanol de segunda geração a partir de um rejeito agroindustrial sólido obtido pela Petrobras a base de mamona.

4. CASTRO, A. M. ; BEVILAQUA, Juliana Vaz ; FREIRE, Denise Maria Guimarães ; Torres, F.A.G. ; SANTAANNA, Lidia Maria de Melo ; GUTARRA, Melissa Limoeiro Estrada ; Barbosa, C.A ; ALMEIDA, Rodrigo Volcan ; MENEZES, R. R. ; CUNHA, Aline Gomes . Processo de produção de lipases por meio de modificação genética de leveduras. Patent (UFRJ-PETROBRAS) 2009.

   Descrição: Este pedido de patente foi depositado pelo Cenpes e pela UFRJ e trata de um processo de obtenção, por meio de técnicas de biologia molecular e genes sintéticos, de uma levedura recombinate (Pichia pastoris) produtora de lipase de Candida antartica.

5. ALMEIDA, R.V.; FREIRE, D.M.G.; MARTINS, O.B.; ALVES, T.L.M.; CAMPBELL, S.M.; BRANCO, R.V. Esterase termoestável imobilizada em suporte de polipropileno microporoso, processo de obtenção da enzima imobilizada, hiperativação da enzima, purificação da enzima e seus usos. 2008. Patent INPI number 0800268-1.

   Descrição: Este pedido de patente foi depositado pela UFRJ e trata de um processo de obtenção de uma esterase termoestável imobilizada em suporte de polipropileno microporoso. São descritos na patente o processo de obtenção da enzima imobilizada, hiperativação da enzima, purificação da enzima e seus usos.

3. Valoração biológica de resíduos agroindustriais

Denise Freire (IQ - UFRJ), Elisa Cavalcanti (IQ - UFRJ) e Erika Aguieiras (IQ-UFRJ)

A detoxificação biológica de resíduos agroindustriais é uma nova linha de pesquisa do grupo que vem apresentando resultados promissores. Um dos primeiros resíduos agroindustriais utilizados em pesquisas do grupo foi o resíduo de mamona utilizada na produção de Biodiesel. As sementes de mamona (Ricinus communis ) contêm uma toxina potente (ricina ) e uma fração de proteína alergênica (isoformas da albumina CB - 1A ou 2S ), que limitam severamente a utilização dos resíduos de mamona após a extração do óleo. A eliminação total ou a inativação de compostos tóxicos a de resíduos de mamona é essencial para que esta possa ser utilizada como alimentação animal , como fertilizante ou em pré-tratamento das águas residuais. Mesmo que o seu destino final seja o aterro , é necessário eliminar a toxicidade do resíduo de modo a evitar a contaminação do solo e de águas subterrâneas.

Além do resíduo de mamona, o grupo iniciou a investigação da biodestoxificação de outros resíduos, tais quais: Pinhão-manso ( Jatropha curcas ), que contém ésteres de forbol e curcina ( nova patente UFRJ - PETROBRAS em andamento ); e resíduos da indústria do café, que contém taninos e outros fatores antinutricionais.

Para essas detoxificações, utilizamos técnicas de fermentação em estado sólido. Através desse processo, além da produção da enzima, que irá valorar os resíduos, podemos destoxificar o resíduo agroindustrial, tornando-o seguro para utilização como ração animal ou fertilizante, sem causar dano ao ambiente.

Objetivos

1. Detoxificar resíduos agroindustriais através de fermentações em estado sólido;

2. Promover a produção de enzimas em resíduos indesejados, diminuindo sua toxidade e promovendo sua valoração;

3. Criar uma oportunidade para pesquisar possíveis aplicações de sólidos fermentados detoxificados, incluindo sua utilização como alimento animal ou para pré-tratamento de águas residuais;

Publicações e Patentes

1. CASTRO, ALINE MACHADO DE ; CASTILHO, LEDA DOS REIS; FREIRE, Denise Maria Guimarães . Characterization of babassu, canola, castor seed and sunflower residual cakes for use as raw materials for fermentation processes. Industrial Crops and Products (Print), v. 83, p. 140-148, 2016.

2. CAVALCANTI-OLIVEIRA, ELISA D. ; SILVA, PRISCILA R. ; ROSA, TAÍS S. ; MOURA, NATHALIA M.L. ; SANTOS, BRUNO C.P. ; CARVALHO, DANIELLE B. ; SOUSA, JOAB S. CARVALHINHO, MAITE T.J.E. ; CASTRO, ALINE M. ; Freire, Denise M.G. . Methods to prevent acidification of Macaúba (Acrocomia aculeata) fruit pulp oil: A promising oil for producing biodiesel. Industrial Crops and Products (Print), v. 77, p. 703-707, 2015.

3. DA SILVA, JOSÉ ANDRÉ CAVALCANTI ; SOARES, VALÉRIA FERREIRA ; FERNANDEZ- LAFUENTE, ROBERTO ; HABERT, ALBERTO CLÁUDIO ; Freire, Denise M.G. . Enzymatic production and characterization of potential biolubricants from castor bean biodiesel. Journal of Molecular Catalysis. B, Enzymatic (Print), v. 122, p. 323-329, 2015.

4. CASTRO, A. M. ; FREIRE, Denise Maria Guimarães ; GODOY, Mateus Gomes de ; TAVARES, Olga Lima Machado ; GUTARRA, Melissa Limoeiro Estrada ; BEVILAQUA, Juliana Vaz ; SANTAANNA, Lidia Maria de Melo . Processo de produção de lipases e valoração de resíduo agroindustrial. 2009. Patent deposit

5. GODOY, MATEUS G. ; FERNANDES, K. V. ; GUTARRA, Melissa Limoeiro Estrada ; MELO, E. J. C. ; CASTRO, A. M. ; MACHADO, O. L. ; FREIRE, DENISE M. G. . Use of Vero cell line to verify the biodetoxification efficiency of castor bean waste.. Process Biochemistry , 47:578-584, 2012.

6. FERNANDES, K.V.; DEUS-DE-OLIVEIRA, N. ; GODOY, M.G. ; GUIMARÃES, Z.A.S. ; NASCIMENTO, V.V. ; MELO, E.J.T. DE ; FREIRE, D.M.G. ; DANSA-PETRETSKI, M. ; MACHADO, O.L.T. . Simultaneous allergen inactivation and detoxification of castor bean cake by treatment with calcium compounds. Brazilian Journal of Medical and Biological Research on line, v. 45, p. 1002-1010, 2012.

7. GODOY, MATEUS G. ; GUTARRA, MELISSA LIMOEIRO ESTRADA ; CASTRO, ALINE MACHADO DE ; TAVARES, OLGA LIMA MACHADO ; FREIRE, DENISE M. G. . Adding value to a toxic residue from the biodiesel industry: production of two distinct pool of lipases from Penicillium simplicissimum in castor bean waste. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology , v. 37, p. 1-9, 2010.

8. GODOY, M.G.; GUTARRA, M.L.E.; MACIEL, F.M.; FELIX, S.P.; BEVILAQUA, J.V.; MACHADO, O.L.T.; FREIRE, D.M.G. Use of a low-cost methodology for biodetoxification of castor bean waste and lipase production. Enzyme and Microbial Technology, 44:317-322, 2009.

9. BEVILAQUA, J.V.; FREIRE, D.M.G.; SANTAANNA, L.M.M.; CASTILHO, L.R.; RIBEIRO, M.C.M.; GUTARRA, M.L.E.; GODOY, M.G. Método de tratamento de rejeito agroindustrial para destoxificação e redução da alergenicidade, com produção de lipases.. 2007. Patent INPI number PI 0703290-0.

10. SANTANNA, L.M.M.; KHALIL, C.N.; PEREIRA JR, N.; MADEIRA, L.S.; FREIRE, D.M.G.; BEVILAQUA, J.V.; GOMES, A.C.; MENEZES, E.P. Processo para a Redução da toxicidade da Torta de Mamona. 2006. Patent INPI number PI0503543-0.

4. Uso de lipases e hidrólise microbiana em biotecnologia ambiental

Denise Freire (IQ - UFRJ) e Magali Camarotta (EQ - UFRJ)

O Fungo Penicillium sp., quando cultivado em meio sólido composto de torta de babaçu, produz hidrolases extracelulares, como lipases, proteases e amilases. Torta de babaçu é um resíduo sólido da produção industrial de óleo de babaçu, sendo portanto uma matéria-prima de baixo custo. Devido ao baixo custo, o processo de produção de hidrolases em meio sólido composto por esse resíduo é considerado economicamente viável. Em comparação com o produto lipolítico comercial, o extrato enzimático de P. Restrictum produzido por fermentação em estado sólido apresenta um custo de produção 47% inferior, para uma taxa de produção de 100 m3 de extrato concentrado por ano. O tempo de retorno seria de 1,5 anos e a taxa interna de retorno seria de 62% para um projeto de 5 anos.

O uso de extrato hidrolítico de Penicillium sp. para pré-tratamento de efluentes de indústria de laticínios, seguido por tratamento biológico anaeróbio (UASB) ou aeróbio (lodo ativado), resultou em aumento significante na remoção de COD, assim como notável diminuição do tempo de residência.

A produção e uso de outros extratos enzimáticos a partir de fungos e bactérias da coleção de microbiologia biotecnológica do laboratório está atualmente em estudo.

Objetivos

1. Estudar a produção de lipases e outras hidrolases através de fermentação em estado sólido utilizando cepas de microrganismos da coleção de culturas do LaBim;

2. Estudar diferentes composições de meio fermentativo baseado em rejeitos sólidos da indústria alimentícia ( óleo de babaçu e torta de soja);

3. Estudar o uso dessas enzimas no pré-tratamento de efluentes ricos em proteínas, óleos e graxas da indústria de laticínios e abatedouros de aves antes dos reatores de tratamento aeróbio e anaeróbio.

Publicações e Patentes

1. DUARTE, JAQUELINE G. ; LEONE-IGNACIO, KASSIA ; DA SILVA, JOSE ANDRE C.; FERNANDEZ-LAFUENTE, ROBERTO ; Freire, Denise M.G. . Rapid determination of the synthetic activity of lipases/esterases via transesterification and esterification zymography. Fuel (Guildford), v. 177, p. 123-129, 2016.

2. DAIHA, KARINA DE GODOY ; BRÊDA, GABRIELA COELHO ; LARENTIS, ARIANE LEITES; FREIRE, Denise Maria Guimarães ; ALMEIDA, RODRIGO VOLCAN . Enzyme technology in Brazil: trade balance and research community. Brazilian Journal of Science and Technology, v. 3, p. 17, 2016.

3. CAMMAROTA, M ; ROSA, D ; DUARTE, I. C. S. ; DUARTE, I. C. S. ; SAAVEDRA, N. K. D. ; VARESCHE, M. B. ; ZAIAT, M. ; FREIRE, DENISE MARIA GUIMARÃES . THE EFFECT OF ENZYMATIC PRE-HYDROLYSIS OF DAIRY WASTEWATER ON THE GRANULAR AND IMMOBILIZED MICROBIAL COMMUNITY IN ANAEROBIC BIOREACTORS. ENVIRONMENTAL TECHNOLOGY , V. 01, P. 01-10, 2012.

4. DAMASCENO, FERNANDA R.C. ; CAMMAROTA, MAGALI C. ; FREIRE, DENISE M. G. . The combined use of a biosurfactant and an enzyme preparation to treat an effluent with a high fat content. Colloids and Surfaces. B, Biointerfaces , v. 95, p. 241-246, 2012.

5. VALADÃO, ALESSANDRA BORMAM ; CAMAROTTA, MAGALI CRISTHE ; FREIRE, DENISE M. G. . Perfomance of anaerobic reactor for treating poultry slaughterhouse wastewater with high fat content after enzymatic hydrolysis.. Environmental Engineering Science , v. 28, p. 1-10, 2011.

6. ALEXANDRE, V. M. F. ; VALENTE, ANGÉLICA ; CAMAROTTA, MAGALI CRISTHE ; FREIRE, DENISE M. G. . Performance Of Anaerobic Bioreactor Treating Fish-Processing Plant Wastewater Pre-Hydrolyzed With A Solid Enzyme Pool. Renewable Energy , v. 36, p. 3439-3444, 2011.

7. VALLADÃO, A.B.G. ; CAMMAROTA, M.C. ; TORRES, A.G. ; FREIRE, D.M.G. . Profiles of fatty acids and triacylglycerols and their influence on the anaerobic biodegradability of effluents from poultry slaughterhouse. Bioresource Technology , v. 102, p. 7043-7050, 2011.

8. VALENTE, ANGÉLICA ; ALEXANDRE, V. M. F. ; CAMAROTTA, MAGALI CRISTHE ; FREIRE, DENISE M. G. . Pré- hidrólise enzimática da gordura de efluente da indústria de pescado objetivando o aumento da produção de metano.. Ciência e Tecnologia de Alimentos (Impresso) , v. 30, p. 483-488, 2010.

9. VALLADÃO, A.B.; FREIRE, D.M.G.; CAMAROTTA, M.C. Evaluation of different pre-hydrolysis times and enzyme pool concentrations on the biodegradability of poultry slaughterhouse wastewater with a high fat content. Water Science & Technology. Water Supply, 60:243-249, 2009.

10. ROSA, D.R.; DUARTE, I.C.S.; SAAVEDRA, N.K.; VARESCHE, M.B.; ZAIAT, M.; CAMMAROTA, M.C.; FREIRE, D.M.G. Performance and molecular evaluation of an anaerobic system with suspended biomass for treating wastewater with high fat content after enzymatic hydrolysis. Bioresource Technology, 100: 6170-6176, 2009.

11. FREIRE, D.M.G.; GUTARRA, M.L.E.; LEITÃO, V.F.; COELHO, M.A.Z.; CAMAROTTA, M.C. Biocatalysis in Enviromental Technology. In: Biocatalysis Research Progress. 1st ed. USA: Nova Science Publishers, p.5-25. 2008.

12. RIGO, E.; RIGONI, R.E.; LODEA, P.; OLIVEIRA, D.; FREIRE, D.M.G.; TEICHEL, H.; DiLUCCIO, M. Comparison of two Lipases in the hydrolysis of oil and grease in wastewater of the swine meat industry. Industrial & Engineering Chemistry Research, 47:1760-1765, 2008.

13. DAMASCENO, F.R.C.; FREIRE, D.M.G.; CAMMAROTA, M.C. Impact of the addition of an enzyme pool on an activated sludge system treating dairy wastewater under fat shock loads, Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 83:730-738, 2008.

14. VALLADÃO, A.B.; FREIRE, D.M.G.; CAMAROTTA, M.C. Enzymatic pre-hydrolysis applied to the anaerobic treatment of effluents from poultry slaughterhouses. International Biodeterioration and Biodegradation, 60:219-225, 2007.

15. LEAL, M.C.M.R.; FREIRE, D.M.G.; CAMAROTTA, M.C.; SANT´ANNA JR, G.L. Treatment of dairy wastewater by combined processes: enzymatic and anaerobic. Process Biochemistry, 41: 1173-1178, 2006.

16. ROSA, D.R.; CAMAROTTA, M.C.; FREIRE, D.M.G. Production and Utilization of a new solid enzymatic preparation produced by Penicillium restrictum in activated sludge systems treating wastewater with high levels of oil and grease. Environmental Engineering Science, 23: 813-822, 2006.

17. CAMAROTTA, M.C.; FREIRE, D.M.G. A Review on Hydrolytic Enzymes in the Treatment of Wastewater with High Oil and Grease Content. Bioresource Technology, 97:2195-2210, 2006.

18. AZEREDO, L.A.I.; CUNHA, C.D.; ROSADO, A.S.; MACRAE, A.; FREIRE, D.M.G.; HAGLER, L.C.S.; SANT´ANNA JR, G.L. New Group-specific 16S rDNA primers for monitoring foaming mycolata during saline waste-water treatment. Biotechnology Letters, 28: 447-453, 2006.

19. FREIRE, D.M.G.; CAMAROTTA, M.C.; CASTILHO, L.R.;SANT'ANNA JR, G.L.; FREIRE, D.D.C.; RUSSO, C. Production process and composition of an enzymatic preparation, and its use for the treatment of domestic and industrial effluents of high fat, protein and/or carbohydrate content. International Patent No. 01973858.2-2405. Application submitted to PCT signatory nations in March 2003.

20. RIBEIRO, M.C.M.; CAMAROTTA, M.C.; SANT'ANNA JR, G.L.; FREIRE, D.M.G. Hydrolitics enzymes and anaerobic degradation dairy wastewaters. Brazilian Journal of Chemical Engineering, 19:175-180, 2002.

21. JUNG, F.; CAMAROTTA, M.C.; FREIRE, D.M.G. Impact of enzymatic pre-hydrolysis on batch activated sludge systems dealing with oily wastewaters. Biotechnology Letters, 24:1797-1802, 2002.

22. BEVILAQUA, J.V.; CAMAROTTA, M.C.; SANT'ANNA JR, G.L.; FREIRE, D.M.G.. Phenol removal through combined biological and enzymatic treatments. Brazilian Journal of Chemical Engineering, 19:151-158, 2002.

23. CAMAROTTA, M.C.; TEIXEIRA, G.; FREIRE, D.M.G. Enzymatic pre-hydrolysis and anaerobic degradation of high fat contents wastewaters. Biotechnology Letters, 23:1591-1595, 2001.

5. Biologia Molecular e Modelagem por Homologia

Denise Freire (IQ - UFRJ), Rodrigo Almeida (IQ - UFRJ) e Fernando Torres (UnB)

Biologia molecular tem sido utilizada como ferramenta para clonagem de enzimas de alta importância tecnológica, especialmente enzimas de fungos filamentosos e enzimas extremófilas. A clonagem de lipases de Penicillium simplicissimum e Pyrococcus furiosus tem sido o foco das últimas pesquisas. Penicillium simplicissimum é um microrganismo cuja temperatura ótima de crescimento é 100oC. Já a lipase de Pyrococcus furiosus apresentou atividade mesmo após tratamento térmico a altas temperaturas.

A determinação da estrutura tridimensional das enzimas através de modelagem comparativa tem sido útil para auxiliar na compreensão dos mecanismos e especificidades das enzimas e contribui para o design de novos biocatalisadores.

Além disso, tem sido investigado, em colaboração com o professor Fernando Torres (Universidade de Brasília – UnB), a expressão e clonagem em Pichia pastoris utilizando genes sintéticos de enzimas promissoras utilizadas na síntese do biodiesel. Uma dessas enzimas já foi expressa com sucesso e a patente foi depositada com a PETROBRAS (número de protocolo 020090118146).

Objetivos

1. Super-expressar enzimas de interesse tecnológico;

2. Compreender mecanismos e especificidades de enzimas de interesse através análise estrutural.

Publicações e Patentes

1. MOURA, MARCELO VICTOR HOLANDA ; DA SILVA, GIULIA PONTES ; MACHADO, ANTÔNIO CARLOS DE OLIVEIRA ; TORRES, FERNANDO ARARIPE GONÇALVES ; FREIRE, Denise Maria Guimarães ; ALMEIDA, RODRIGO VOLCAN . Displaying Lipase B from Candida antarctica in Pichia pastoris Using the Yeast Surface Display Approach: Prospection of a New Anchor and Characterization of the Whole Cell Biocatalyst. Plos One, v. 10, p. e0141454, 2015.

2. CASTRO, A. M. ; BEVILAQUA, Juliana Vaz ; FREIRE, Denise Maria Guimarães ; Torres, F.A.G. ; SANTAANNA, Lidia Maria de Melo ; GUTARRA, Melissa Limoeiro Estrada ; Barbosa, C.A ; ALMEIDA, Rodrigo Volcan ; MENEZES, R. R. ; CUNHA, Aline Gomes . Processo de produção de lipases por meio de modificação genética de leveduras. Patent (UFRJ-PETROBRAS) 2009.

3. ALMEIDA, R.V.; FREIRE, D.M.G.; MARTINS, O.B.; ALVES, T.L.M.; CAMPBELL, S.M.; BRANCO, R.V. Esterase termoestável imobilizada em suporte de polipropileno microporoso, processo de obtenção da enzima imobilizada, hiperativação da enzima, purificação da enzima e seus usos. 2008. Patent INPI number 0800268-1

4. GUTARRA, MELISSA L. E. ; ROMERO, OSCAR ; ABIAN, OLGA ; TORRES, FERNANDO A. G. ; FREIRE, DENISE M. G. ; CASTRO, ALINE M. ; GUISAN, JOSE M. ; PALOMO, JOSE M. .Enzyme Surface Glycosylation in the Solid Phase: Improved Activity and Selectivity of Candida Antarctica Lipase B. CHEMCATCHEM , v. xx, p. n/a-n/a, 2011.

5. ALMEIDA, R.V.; BRANCO, R.V.; SANTOS, B.C.P.; LIMA, C.S.; CAMPBELL, S.M.; MARTINS, O.B.; ANTUNES, O.A.C.; FREIRE, D.M.G. Immobilization of a Recombinant Thermostable Esterase (Pf2001) from Pyrococcus furiosus on Microporous Polypropylene: Isotherms, Hyperactivation and Purification. Biochemical Engineering Journal, 39:531-537, 2008.

6. LARENTIS, A.L.; ALMEIDA, R.V.; CARDOSO, A.M.; RÖSSLE, S.C.; Almeida, W.I.; BISCH, P.M.; MARTINS, O.B.; ALVES, T.L.M. Expression and homology modeling of 2 – aminobiphenyl-2-3- diol 1,2-dioxygenase (CarB) from Pseudomonas stutzeri carbazole degradation pathway. Cell Biochemistry and Biophysics, 44:503-508, 2006.

7. LARENTIS, A.L.; ALMEIDA, R.V.; CARDOSO, A.M.; Almeida, W.I.; RÖSSLE, S.C.; BISCH, P.M.; ALVES, T.L.M.; MARTINS, O.B. Homology Modeling of the Oxygenase Component of Carbazole 1,9a-Dioxygenase (CarAa) Involved in Petroleum Denitrogenation Pathway of Pseudomonas sp..Brazilian Archives of Biology and Technology, 49:53-61, 2006.

6. Aplicação de Lipases para produção de biodiesel

Denise Freire (IQ - UFRJ), Elisa Cavalcanti (IQ - UFRJ) e Erika Aguieiras (IQ - UFRJ)

Lipases de plantas são especialmente interessantes para produção de biodiesel devido ao seu baixo custo, sua facilidade de purificação e sua ampla disponibilidade a partir de recursos naturais, sem necessidade de produção através de tecnologia genética molecular. Lipases de plantas também apresentam boa seletividade quanto ao substrato, tornando-as valiosas para a indústria química.

A produção de biodiesel pela rota de hidroesterificação contorna desvantagens comuns encontradas no processo convencional de transesterificação. O processo de hidroesterificação é conduzido em dois estágios. O primeiro é a hidrólise de tri-, di- e monoacylglicerols, produzindo ácidos graxos livres e glicerol. Depois desse estágio, a fase orgânica contendo os ácidos graxos livres é spearada da fase aquosa que contém o glicerol e os biocatalisadores. A seguir, os ácidos graxos são esterificados com um álcool para obtenção do biodiesel. O processo de hidroesterificação permite a utilização de outros materias como gordura animal, óleo vegetal, óleo de cozinha usado e outros. Isso gera uma vantagem em relação ao processo convencional de transesterificação, que invevitavelmente gera sabão na presença de ácidos graxos, inativando o catalisador e tornando difícil a separação do biodiesel do glicerol, afetando o rendimento do processo.

Vantagens:

• Produtividade e rendimento similares ao processo convencional de hidrólise (Colgate-Emery);
• Menor demanda energética (baixas temperaturas e pressões);
• Menor geração de subprodutos indesejáveis (glicerina crua e ácidos graxos degradados);
• Geração de glicerina pura;
• Utilização de qualquer matéria bruta gordurosa, independente de acidez ou teor de umidade;
• Facilidade de produção e uso de enzimas vegetais, que são tão eficientes quanto lipases microbianas;

Objetivos

1. Produzir ésteres metílicos pela hidrólise de matéria prima gordurosa (óleos vegetais ou resíduos agroindustriais) utilizando lipases vegetais e microbianas com subsequente esterificação com catalisador heterogeneo ácido.

Publicações e Patentes

1. RIBEIRO, B. D. ; CASTRO, A. M. ; COELHO, M. A. Z. ; FREIRE, DENISE M. G. . Production and use of lipases in bioenergy: a review from the feedstocks to biodiesel production. Enzyme Research, v. 2011, p. 1-16, 2011.

2. CAVALCANTI, ELISA D C ; SILVA, P. R. ; RAMOS, A. P. ; ARANDA, D. A. G. ; FREIRE, DENISE M. G. . Study of Soybean oil Hydrolysis Catalyzed by Thermomyces lanuginosus Lipase and Its Application to Biodiesel Production via Hydroesterification.. Enzyme Research, v. 2011, p. 1-8, 2011.

3. SOUSA, J.; CAVALCANTI, E.D.C.; ARANDA, D.A.G.; FREIRE, D.M.G. Application of lipase from the physic nut (Jatropha curcas L.) to a new hybrid (enzyme/chemical) hydroesterification process for biodiesel production. Journal of Molecular Catalysis. B, Enzymatic, 65:133-137, 2010.

4. ARANDA, D.A.G.; ANTUNES, O.A.C.; FREIRE, D.M.G.; LAGO, R.C.A.; CAVALCANTI, E.D.C.; SOUSA, J. Produção de ácidos graxos catalisada por lipases não purificadas de sementes ou frutos vegetais para subsequente esterificação por catálise ácida. 2006. Patent INPI number PI0603824-7.